Введение

Идиопатический нефротический синдром (НС) характери­зуется тяжелой протеинурией, гипоальбуминурией, отеками и гиперлипидемией и возникает главным образом у детей. По отношению к стероидной терапии НС делится на стероидчувствительный и стеродрезистентный (СРНС). В детском возрасте большинство пациентов отвечают на глюкокортикоидную терапию, однако для 10—20 % больных отмечается стероидная резистентность, что является причиной прогрессирования заболевания с формированием почечной недостаточности [1, 2]. Накопленные данные о патогенезе идиопатического НС позволяют предположить, что часть детей с СРНС могут иметь первичный дефект барьера клубочкового фильтрата [3-6]. Недавние исследования показали, что мутации в гене NPHS2, кодирующего подоцин (структурный белок подоцита), ответст­венны за развитие аутосомно-рецессивного НС[4], но также могут быть причиной формирования спорадически возникшего СРНС, наблюдаемого, по данным разных авторов, в 10,5-28 % [1, 2, 7, 8]. Однако в других случаях в основе патогенеза СРНС лежат иммунологические сдвиги с преимуществен­ным дисбалансом Т-лимфоцитов. Т-клетки у больных СРНС секретируют циркулирующий фактор, который повреждает клубочковый фильтрационный барьер [6]. В последнее время были предприняты усилия по изучению фармакокинетики глюкокортикоидов (ГК) у детей с почечной патологией, их взаимодействию с глюкокортикоидными рецепторами (ГР) и аффинности последних [9-11]. Молекулярные механизмы, лежащие в основе стероидной резистентности в спорадических формах НС, обусловленного дисбалансом Т-лимфоциты, до сих пор не выявлены.

Влияние на клетки глюкокортикоиды оказывают через глюкокортикоидный рецептор. Рецепторы связываются с ГРЭ-элементами, расположенными в промоторных областях генов-мишеней и регулируют их транскрипционную активность. Также рецепторы взаимодействуют с другими транскрипционными факторами посредством белок-белок взаимодействий и взаимно репрессируют или стимулируют друг друга в транскрипционной активности других генов.

Белок глюкокортикоидного рецептора состоит из нескольких доменов. ДНК-связывающий домен расположен в центральной части молекулы глюкокортикоидного рецептора. C-конец глюкокортикоидного рецептора является гормон-связывающим доменом. Внутри этого домена расположен также трансактивирующий район тау-2 [12] .

Район тау-1 расположен в N-концевом (иммуногеном) домене глюкокортикоидного рецептора. При этом район тау-1 обеспе­чивает 60-70 % активности этого белка. Именно его избыток блокирует транскрипцию с минимального CYO-промотора in vivo и in vitro [13].

Иммуногенный домен глюкокортикоидного рецептора коди­руется одним большим экзоном, каждый из цинковых пальцев - отдельным экзоном, и пять экзонов кодируют гормон-связывающий домен [14].

Мутации в гене глюкокортикоидного рецептора приводят к развитию спорадического синдрома глюкокортикоидной резистентности (sporadic glucocorticoid resistance syndrome). А для полиморфного маркера rs41423247 (BclI)показана ассоциация с повышенным весом. Этот полиморфный маркер находится в 400-м положении в матричной РНК и представляет собой замену С/G, гомозиготный G аллель ведет к высокому уровню инсулина и большей инсулин-резистентности по сравнению с группой, содержащей генотип CC или GC. Кроме того, пока­зана ассоциация между наличием этого маркера у пациентов и повышенной брюшной тучностью в среднем возрасте [15].

Полиморфизм rs6195 (N363S) идентифицирован в 363-м кодоне во 2-м экзоне, этот полиморфный маркер выглядит как изменение ААТ на AGT, в результате в белке происходит замена аспарагина на серин. Была описана связь данного полиморфизма с глюкокортикоидной гиперчувствительностью [16].

Два полиморфных маркера, rs6189 и rs6190 (ER22/23EK), жес­тко сцеплены между собой и представляют собой две мутации в положениях 22 и 23 (2-й экзон). Первая мутация незначима, поскольку не ведет к аминокислотной замене (замена GAG на GAA), вторая же мутация в 23-м кодоне представляет собой замену AGG на AAG и ведет к замене аргинина на лизин. По некото­рым данным, при наличии этого полиморфизма у пациентов в крови присутствует более низкая концентрация холестерина и С-реактивного белка, а также отмечается снижение эффектив­ности дексаметазона [17]. Ассоциация полиморфного маркера rs10052957 (Tth111I) с высоким уровнем кортизола показана в популяции мужчин-шведов. При наличии этой мутации про­исходит замена аденина на гуанин в 256-м положении мРНК.

В связи с тем что стероидные препараты широко используются для лечения НС, нами была исследована ассоциация полиморф­ных маркеров rs10052957, rs41423247, rs6195 (rs57667111), rs6189, rs6190 в гене глюкокортикоидного рецептора с резистентностью к глюкокортикоидной терапии (см. рисунок).

Рисунок. Позиционирование полиморфизмов гена глюкокортикоидного рецептора у детей с СРНС.

Материал и методы

Под нашим наблюдением находились 58 (35 девочек, 23 мальчи­ка) детей в возрасте от 5 месяцев до 18 лет, средний возраст - 11,8 ± 5,45 года. Всем детям был диагностирован СРНС на основании стандартного обследования, в которое входило определение сывороточного белка, альбумина, холестерина, триглицеридов, креатинина, а также исследование мочи. Стероидрезистентность была диагностирована в случае отсутствия ответа на терапию при приеме преднизолона в дозе 2 мг/кг/сут в течение 6-8 недель. Всем детям проведена нефробиопсия с определением морфологической формы. Были выявлены следующие морфо­логические формы: фокально-сегментарный гломерулосклероз (29 детей), минимальные изменения (9), IgM-нефропатия (6), IgA-нефропатия (5), мембрано-пролиферативный (5), мезангиопролиферативный (3) и 1 ребенок с фибропластическим гломерулонефритом. Все дети находились на стационарном обследовании и лечении в Российской детской клинической больнице в отделении нефрологии с 2002 по 2011 г.

Контрольная группа представлена 40 пациентами в возрасте 27-73 лет без воспалительных и эндокринных заболеваний.

В работе использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq, полученную от фирмы “Fermantas” (Вильнюс, Литва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО “Синтол” (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкуба­ции образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1 %-ного додецилсульфата натрия [18].

Амплификация полиморфного участка гена проведена с по­мощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере “Терцик” (ЗАО “ДНК- Технология”, Москва) в 25 мкл реакци­онной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH = 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорида магния, 0,2 мМ dNTP, по 33 нг праймеров, 1,5 ЕД полимера­зы Taq, 50-100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 94 °C/2 мин - 1-й цикл; 95 °C/30 с, 60 °C/30 с (62 °C/30 с), 72 °C/20 с - 35 циклов; 72 °C/6 мин - последний цикл. Размеры продуктов амплификации для полиморфных маркеров были следующими: 296 п. о. для rs10052957, 382 п. о. для rs41423247, 261 п. о. для rs6195 (rs57667111), 232 п. о. для rs6189 и rs6190 (табл. 1).

Таблица 1. Праймеры и рестриктазы, используемые в работе.

Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофо­реза в 8%-ном полиакриламидном геле и в 2%-ном агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. В качестве маркера молекулярной массы использованы ДНК плазмиды pUC19, расщепленной рестриктазой MspI.

Статистическая обработка данных проведена при помощи компьютерной программы для статистического анализа Statistica 7,0. Для проверки статистической значимости различий часто­тных показателей использовали критерий χ² по Пирсону. При количестве наблюдений меньше 5 использован точный критерий Фишера. Достоверными считались различия при p < 0,05; 0,05 ≤p < 0,1 рассматривали как тенденцию к различию.

Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR). Вычисления произво­дили с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (David Hutchon). OR = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR > 1 - как положительную ассоциацию (“повы­шенный риск развития патологии”), OR < 1 - как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием (“пониженный риск развития патологии”). Также рассчитывали величину доверительного интервала (CI, confidence interval) - интервала значений, в пределах которого с вероятностью 95 % находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра, в данном случае значение OR.

Результаты и обсуждение

Человеческий ген ГР NR3C1 располагается на хромосоме 5q31.3 и состоит из девяти экзонов [19]. Полиморфизм, т. е. изменения в последовательности ДНК с частотой более 1 % в здоровой популяции в человеческом гене ГР, может приводить к нарушению формирования комплекса ГК-ГР, а затем изменять трансактивные и/или трансподавляющие процессы.

В настоящее время обнаружено множество полиморфизмов, однако лишь немногие из них функциональные. Выявлены ассо­циации полиморфных маркеров IthIIII (rs10052957), ER22/23EK (rs6189/rs6190), N363S (rs6195), BclI (rs41423247) и GR-9β (rs6198) с различными метаболическими параметрами и массой тела, аутоиммунными и кардиоваскулярными заболеваниями. Эти генетические полиморфные маркеры ассоциированы с чувстви­тельностью к ГК и изменением уровня кортизола [20] и могут объяснить различия эффективности ГК терапии.

В нескольких исследованиях была изучена ассоциация этих поли­морфных маркеров с воспалительными заболеваниями кишечника, в которых не было выявлено ассоциации между полиморфным маркером ER22/23EK и эффективностью ГК [21]. Три полиморф­ных маркера изучены на больных с рассеянным склерозом TthIIII, ER22/23EKи 9β-G, гаплотипы которых были ассоциированы с резистентностью к ГК и более быстрым прогрессированием забо­левания. Однако именно наличие полиморфизма ER22/23EK, а не двух других полиморфизмов повлияло на полученный результат [21]. В нашем исследовании мы получили высокую ассоциацию стероидной резистентности при НС у детей с аллелем А как в гомо­зиготном, так и в гетерозиготном состоянии полиморфного маркера ER22/23EK (χ² = 10,4; p = 0,001, и χ² = 9,66; p = 0,002) (табл. 2), в то время как распределение полиморфного маркера TthIIII практи­чески соответствовало таковой в контрольной группе (табл. 3).

Таблица 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного ER22/23EK гена NR3C1 по сравнению с контрольной группой.

Таблица 3.Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного TthIIIIгена NR3C1 по сравнению с контрольной группой.

Проведено лишь несколько исследований роли полиморфизма N363S в чувствительности на экзогенные ГК. V. Szabo et al. (2007) [22] продемонстрировали варианты полиморфных маркеров NR3C1-гена, способствующие развитию стероидной гипертензии. У 102 пациентов, перенесших фоторефракционную кератэктомию и получавших стероиды в рамках послеоперационной терапии, отмечена значительная корреляция между N363S-гетерозиготным генотипом и глазной гипертензией. Кроме того, 48 пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна, получавших преднизолон или дефлазакорт, N363S-носители GG-генотипа дольше сохраняли мышечную функцию [23]. Однако в исследовании ассоциации данного полиморфного маркера с воспалительными заболе­ваниями кишечника не выявлено никаких ассоциаций [24]. Аналогичные данные получены нами. Распределение частот аллелей и генотипов данного полиморфного маркера N363S не отличалось от контрольной группы (табл. 4).